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                      土壤DNA提取的最佳方案

                      2014-12-15 13:40:42      点击:
                      简介

                              土壤宏基因组学技术是近来发展比较迅速的一种新方法,是研究土壤微生物生态学的基础,也是获是土壤中各种基因资源的一种有效手段。宏基因组学又叫环境基因组学(Environmental Genomics)或群体基因组学(Community Genomics),定义为利用现代基因组技术直接研究自然状态环境中的有机体群落,而不需要分离、培养单一种类的微生物。研究环境基因学的前提就是要获得质量足够好的DNA,由于土壤微生物往往会与土壤其他组分紧密结合,这就增加了提取土壤DNA的难度。常用的方法包括直接提取法和间接提取法。直接提取法是将样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理,使其释放DNA,继而抽提纯化;间接提取法是首先去除土壤等杂质,通过不同的离心速度从土壤中分离出细胞,然后对细胞进行抽提。直接提取法提取的DNA片段较小(1~50kb),提取率高,操作简单;间接提取法提取的片断较大(20~500kb),纯度高,但操作繁琐,有些微生物在分离过程中会丢失得到的DNA并非土壤样品中的全基因组(宏基因组),目前已经很少研究者会采用这种方法。
                              直接法纯化土壤DNA最大的难点是如果有效除去与核酸分子非常相似的腐殖酸,因为痕量的腐殖酸的存在对后续的实验影响严重,比如PCR失败等。传统的纯化方法几乎不能有效除去腐殖酸,GBCBIO Technologies公司经过技术公关,在如何有效除去腐殖酸等抑制因子上取得重大突破,研发出高效的腐殖酸吸附剂,能够彻底除去腐殖酸等抑制因子,腐殖酸吸附剂是添加在裂解的过程中,后续的纯化采用硅胶柱的方式,因而操作上更简单,无繁琐的操作。GBCBIO公司的土壤DNA提取试剂盒能与进口MOBIO公司的相媲美。

                      实验流程:

                      1. 0.3-0.5g土壤置于2ml离心管中,加入0.4g Glass Beads,再加入780μl Buffer C1100μl Buffer C2涡旋器高速震荡3-5min

                      注意:Buffer C2是我司独特的腐殖酸除去剂,100μl对大部分样品来说足以有效除去腐殖酸等抑制因子。对一些腐殖酸含量特别丰富的土壤, Buffer C2的量可以适当增加,但不能超过250μl,否则会严重影响DNA的得率。

                      2. 加入100μl Buffer C3C3如有沉淀37水浴完全溶解后再用),涡旋混匀。70水浴处理10min。期间振荡几次。

                      注意:如果要纯化革兰氏阳性菌的DNA,请在70处理完后,再90水浴处理2min

                      3. 12000 rpm(~13000×g)离心1钟,转650μl上清到1.5ml离心管中,加入150μl BufferC4混匀。

                      4. 冰上放置5min12000 rpm(~13000×g)离心1钟。

                      5. 转移上清到新的2ml离心管中,加入0.7倍的异丙醇,颠倒混匀,12000 rpm(~13000×g)离心2钟。

                      注意:如果是DNA含量很低的土壤样品,建议离心前-20℃放置1小时。

                      6.倒掉上清,倒置离心管于吸水纸上30-60秒。加入100μl灭菌去离子水,再加入350μl Buffer C5(必须把Buffer C5混匀后再吸取),涡旋混匀,70水浴放置数分钟,至沉淀完全溶解即可。

                      7. 12000 rpm(~13000×g)离心1钟,400μl转移上清到新的1.5ml离心管中,加入150μl无水乙醇,混匀。

                      8. 将上一步所得溶液加入到GBC吸附柱中(吸附柱放入收集管中),12000rpm离心30秒,倒掉滤过液重新套回收集管。

                      9. GBC吸附柱中加入500 μl Buffer WB12,000 rpm (~13,000×g ) 离心30 ,倒掉废液,将GBC吸附柱放入收集管中。

                      10. GBC吸附柱 中加入650 μl DNA Wash Buffer使用前请先检查是否已加入无水乙醇12,000 rpm (~13,000×g ) 离心30 秒,倒掉废液,GBC吸附柱放入收集管中。

                      11. GBC吸附柱 中加入650 μl DNA Wash Buffer12,000 rpm (~13,000×g ) 离心30秒,倒掉废液,将GBC吸附柱放入收集管中。

                      12. 12,000 rpm(~13,000×g)离心分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

                      13. GBC吸附柱转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100 μl 洗脱缓冲液TE或灭菌去离子水,室温放置2-5 分钟,12,000 rpm (~13,400×g ) 离心分钟,将溶液收集到离心管中。

                      注意:为增加基因组DNA的得率,可将离心得到的溶液再加入吸附柱中,室温放置分钟,12,000 rpm(~13,400×g )离心分钟。洗脱缓冲液体积不应少于30 μl,体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)pH 值低于7.0 会降低洗脱效率;且DNA 产物应保存在-20,以防DNA 降解。

                       

                      实验结果

                      腐殖酸吸附剂(Buffer C2)使用效果比较
                      在土壤样品裂解时,比较加与不加Buffer C2的所获得的裂解液澄清度。从上图看,加有Buffer C2的样品,颜色明显浅很多,说明Buffer C2对出去腐殖酸、色素等效果明显。
                      1,2:裂解时加入Buffer C2
                      3,4: 裂解时未加Buffer C2

                      裂解液加Buffer C4进一步沉淀除杂效果:
                      上一步获得的裂解液上清加入Buffer C4进一步处理,沉淀离心除杂,裂解时加有Buffer C2(腐殖酸吸附剂)的,再经Buffer C4处理几乎不再有颜色,而不加Buffer C2的颜色还很深。
                      1,2:裂解时加有Buffer C2
                      3,4:裂解时不加Buffer C2

                       
                      1, 2: SDS高盐酚氯仿抽提法
                      3, 4: 使用Soil DNA Kit提取
                      1, 3: 为花基土壤
                      2, 4: 河边淤泥
                       
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                       D8105

                       D8106

                       D8107

                       50T

                       100T

                      200T 

                       570.00

                      960.00 

                       1780.00


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